На месте нынешнего Национального Ботанического сада Грузии находились три небольших сада, принадлежащих грузинским правителям. Основанные в начале XVII века, они были задокументированы французским исследователем Жаном Шарденом (1643-1713 годы) Вахушти Багратиони (в его картах, в 1735 году). Та планировка садов сохранилась до персидского нашествия 1795 года.
В начале XIX века сад находился под управлением казны Российской империи. В 1845 году по указу губернатора Михаила Воронцова он был официально переименован в Тифлисский Ботанический сад (ранее известный как Царский сад). В 1872 году на его территории был возведены первые две теплицы, для тропических и субтропических растений. В 1888 году был создан питомник растений, тогда же был основан Центр Флористики.
Между 1886 и 1904 годами Ботанический сад был расширен на запад, а к середине прошлого века к нему было добавлено старое мусульманское кладбище на правом берегу Цавкисискали и северо-восточный склон горы Тавор. В период с 1910 по 1914 годы российский ботаник и археолог Ф. И. Горепкин внес значительный вклад в развитие сада — около 1500 растений были перевезены им с Кавказских гор. Под его руководством была выделена территория, посвященная флоре Кавказа.
В настоящее время Ботанический сад занимает площадь в 128 гектар. Здесь представлены более 4,500 видов флоры со всего мира, около 700 видов являются эндемиками Кавказа, из которых 370 включены в Красную книгу.